實(shí)驗(yàn)名稱：超聲實(shí)現(xiàn)離體H-22腫瘤細(xì)胞快速磁性標(biāo)記研究

研究方向：生物醫(yī)學(xué)

測試目的：

細(xì)胞磺性標(biāo)記所采用的標(biāo)記物多為超順磁氧化鐵(SPIO)納米微粒，由于細(xì)胞膜表面和SPIO表面都帶負(fù)電荷，二者相互排斥，細(xì)胞在自然狀態(tài)難以攝取氧化鐵顆粒。為提高細(xì)胞標(biāo)記率，達(dá)到磁性標(biāo)記細(xì)胞的目的，一般都是通過載體或轉(zhuǎn)染劑對顆粒表面進(jìn)行修飾，通過吞噬、液相胞飲等作用促進(jìn)細(xì)胞對它們的攝取。近年還有人將磁性粒子與抗體和受體結(jié)合，通過細(xì)胞表面相應(yīng)的受體使磁性粒子與細(xì)胞結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。還可將磁性氧化鐵粒子制成特定的標(biāo)記物，通過哺乳類動物細(xì)胞非特異性膜表面吸收過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，用SPIO對目標(biāo)細(xì)胞標(biāo)記時，將SPIO與與轉(zhuǎn)染試劑通過一定方式復(fù)合，然后與目標(biāo)細(xì)胞一起放入培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，一般需要較長的孵育時間(24一48h)。SPIO微粒通過非特異性膜表面吸收過程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

葡聚糖包被的超小型超順磁納米粒子是目前應(yīng)用最為廣泛的磁共振成像對比劑，最早被用于體外細(xì)胞磺性標(biāo)記試驗(yàn)。但相比于標(biāo)準(zhǔn)尺寸(50-150nm)或微米級的氧化鐵微粒對比增強(qiáng)效果也較弱。使用體積大些的葡聚糖包被的SPIO標(biāo)記細(xì)胞時胞質(zhì)內(nèi)Fe顆粒較顆粒小者多，標(biāo)記效果好。另外，用大尺寸的如微米級尺寸的氧化鐵微粒可實(shí)現(xiàn)對單個細(xì)胞的磁標(biāo)記進(jìn)而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的磁共振成像。這也是目前一個嶄新的研究方向，但由于細(xì)胞膜的保護(hù)作用，如何將這些大尺寸的氧化鐵微粒加載進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中是一個有待解決的問題。

測試設(shè)備：ATA-8202射頻功率放大器、信號發(fā)生器、超聲探頭、水槽、蒸餾水等。

實(shí)驗(yàn)過程：

利用化學(xué)共沉淀法自行合成葡聚糖包被的超順磁納米氧化鐵水基磁懸液，其核心顆粒直徑10~20nm，濃度可以根據(jù)需要自行調(diào)整。在此之前，曾經(jīng)采用生化孵育的安全質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25ug/mL且在輸出電功率1W的條件下進(jìn)行了裝載實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)作用時間在2min以內(nèi)該功率的超聲對細(xì)胞活性幾乎沒有影響，但由于細(xì)胞懸液中SPIO微粒濃度太小，裝載效果不理想。所以本次實(shí)驗(yàn)選用較大的SPIO濃度，按其在細(xì)胞懸液中的最終濃度分為A、B、C、D、E5組，各組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為分別為22.5、90、410、1500、2250ug/mL且使超聲發(fā)生器輸出電功率為2W時進(jìn)行超聲裝載實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)裝置如圖：

圖1：實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

本次實(shí)驗(yàn)考察當(dāng)探頭激勵頻率1.43MHz，發(fā)生器輸出電功率2w，細(xì)胞懸液中所含SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)在22.5~2250ug/mL，，超聲作用時間在10~120s條件下，細(xì)胞標(biāo)記情況及活性。

1、細(xì)胞標(biāo)記結(jié)果

普魯士藍(lán)顯示陽性的為已標(biāo)記的細(xì)胞，當(dāng)SPIO在細(xì)胞懸液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為410ug/mL，超聲發(fā)生器輸出電功率為2w，探頭中心頻率1.43MHz，超聲作用10s時H-22細(xì)胞的標(biāo)記效果，細(xì)胞陽性率約為82%。而未經(jīng)超聲處理的細(xì)胞懸液，將其與納米超順磁氧化鐵水基磁懸液一起在37℃孵育箱中孵育30min，然后用普魯士染色，光鏡下觀察，幾乎沒有細(xì)胞被標(biāo)記，可見不經(jīng)超聲處理，僅進(jìn)行短時間孵育細(xì)胞是不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記，也就是說在沒有超聲的參與情況下，短時間內(nèi)SPIO微粒不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。證明超聲作為一種外界力量確實(shí)可以使大顆粒物質(zhì)一納米氧化鐵微粒進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞磁性標(biāo)記。

為了研究細(xì)胞的標(biāo)記率與超聲處理時間、SPIO濃度之間的量化關(guān)系，在聲學(xué)條件為1.43MHz，輸出電功率為2W時，對不同的超聲處理時間、SPIO濃度條件下，任取10個顯微視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)SPIO對細(xì)胞的標(biāo)記率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示不同SPIO濃度時細(xì)胞標(biāo)記率(%)與超聲處理時間t(s)之間的關(guān)系如圖2。

圖2不同SPIO濃度時超聲輻射時間與細(xì)胞標(biāo)記率之間的關(guān)系

特定SPIO濃度時，標(biāo)記率和超聲作用時間的關(guān)系：當(dāng)SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.5ug/mL時，隨著超聲作用時間增長，細(xì)胞標(biāo)記率近似直線提高，但從整體來看，細(xì)胞標(biāo)記率較低，當(dāng)超聲作用時間為120s時，標(biāo)記率不足25%。當(dāng)加入的SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90~2250ug/mL時，標(biāo)記率和超聲作用時間呈現(xiàn)振蕩關(guān)系。除410ug/mL外，超聲作用時間低于30s，隨時間延長標(biāo)記率下降。30~60s之間，隨時間延長，標(biāo)記率提高；60s后，隨時間延長，標(biāo)記率又呈下降趨勢。

超聲作用時間一定，標(biāo)記率和SPIO濃度間關(guān)系，從整個標(biāo)記結(jié)果來看，超聲作用時間在60s內(nèi)，細(xì)胞標(biāo)記率相對較高，超過60s后，標(biāo)記率基本都在下降。當(dāng)超聲作用時間為30s，SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為410ug/mL(C組)，細(xì)胞標(biāo)記率超過90%，SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高(如1500ug/mL(D組)和2250ug/mL(E組))或質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低(如22.5ug/mL(A組))細(xì)胞標(biāo)記率均不足20%；說明SPIO在對H-22細(xì)胞標(biāo)記時存在一個最佳濃度，濃度過高或過低，都會使標(biāo)記效果變差。

標(biāo)記率與SPIO質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲作用時間之間確切關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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